ULOGA I ZNAČAJ ŽIVOTINJA U TOKSIKOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA

U grupu eksperimentalnih životinja, odnosno životinja koje se koriste u labaratorijskim eksperimentima, ubrajaju se praktično sve vrste životinja, od protozoa do primata. Većina ovih životinja je prijemčiva na bol, patnju i stres što predstavlja naučnu i etičku osnovu njihove zaštite. Dosadašnja praksa pokazuje da se ekspermentalne životinje koriste u raznim naučnim laboratorijima:

• u pretkliničkim istraživanjima novih potencijalnih lekova,
• u ispitivanju efikasnosti i štetnosti gotovih proizvoda različitih industrijskih grana,
• u svrhu profesionalnog usavršavanja naučnih radnika,
• u obrazovne svrhe u školama i na fakultetima u praktičnoj nastavi (iz biologije, anatomije, fiziologije, biohemije, farmakologije, anesteziologije, toksikologije, patološke fiziologije i morfologije, hirurgije, kliničke dijagnostike i dr.). (1)

Predkliničko ispitivanje potencijalnih lekova obuhvata biohemijska i laboratorijska istraživanja na životinjama i in vitro ispitivanja na ćelijskim kulturama. Ova ispitivanja prethode kliničkim ispitivanjima i vrše se sa ciljem da se prikupi dovoljno dokaza o prihvatljivoj potencijalnoj štetnosti i kliničkoj primeni leka. Prva faza predkliničkog ispitivanja jeste farmakološki odabir (eng. screening) supstanci koje imaju zadovoljavajući toksikološki profil, a zatim ulaze u detaljnija istraživanja farmakološkog profila. Samo supstance koje su pokazale efekat i relativnu sigurnost u predkliničkim istraživanjima ulaze u nastavak istraživanja na ljudima. (2)

U ovom seminarskom radu biće obrađena uloga i značaj životinja u toksikološkim istraživanjima u okviru predkliničkih ispitivanja potencijalnih lekova. U današnjem društvu, s jedne strane stoje stavovi udruženja za zaštitu životinja, često praćeni pretnjama i agresijom na laboratorije koje koriste eksperimentalne životinje, a s druge strane civilizacijska potreba za napretkom medicine i drugih bioloških nauka koje kao glavni cilj imaju dobrobit i zdravlje čoveka. (1)
Zaštita prava i dobrobit eksperimentalnih životinja osigurana su brojnim međunarodnim propisima:

• Univerzalna deklaracija prava životinja (UNESCO, 1978),
• Rezolucija Svetskog lekarskog udruženja o upotrebi životinja u eksperimentalne svrhe (Hong Kong, 1989),
• Evropska konvencija o zaštiti kičmenjaka koji se koriste u eksperimentalne i druge naučne svrhe (Strazbur, 1989),
• Univerzalna deklaracija o dobrobiti životinja (WSPA, 2000). (1)

Iako su danas razvijene brojne metode ispitivanja lekova u in vitro uslovima, smatra se da su ispitivanja na eksperimentalnim životinjama neophodna i da se samo na taj način mogu predvideti eventualni toksični efekti kod ljudi. Eksperimentima na životinjama može se proučiti bilo koja vrsta toksičnih efekata i njihovi mehanizmi na naučno prihvatljiv način. Pri tome se istraživači trebaju ponašati racionalno i koristi samo onoliko životinja koliko je potrebno za uspešno izvođenje studije i tumačenje rezultata. (3)

 Istorija istraživanja na životinjama

Prvi pisani trag o korištenju životinja u sticanju znanja datira još iz vremena Stare Grčke, gde su se obavljale prve vivisekcije, a prvi primeri su objavljeni u knjizi „Corpus Hippocraticum“ oko 400. god pre Hrista. Stari Rim je također imao svog velikog lekara i eksperimentatora na području medicine, Galena, koji je u drugom veku pre Hrista eksperimentirao na svinjama, psima i majmunima i postavio temelje medicinskoj praksi kako tog doba, tako i vekovima koji su sledili. U srednjem veku, eksperimentalna znanost je zamrla gotovo čitav milenijum u delu starog sveta. Antička istraživanja na području biomedicine doživljavaju svoj preporod u arapskoj medicini, a jedan od najpoznatijih lekara tog doba bio je Avenzoar, koji u 12. veku provodi sekcije i zahvate na životinjama, pre nego ih pokuša izvesti na ljudima u svrhu lečenja. (4)
Procvat empirijske znanosti u doba Renesanse, oko 15. veka, se osetio i na području istraživanja na životinjama. U početku su to bila istraživanja na području anatomije, gdje možemo istaknuti Vesaliusa, i njegovo delo „De Humani Corporis Fabrica“, 1543. Fiziološki procesi se počinju proučavati od 17. veka, i već 1655. irski fiziolog Edmund O'Meara kaže da „nedostojno i jadno mučenje životinja pri vivisekciji dovodi telo životinje u neprirodno stanje“ i dovodi u pitanje pouzdanost rezultata dobijenih na taj način. Zamerka eksperimentiranju na životinjama u tom dobu je bila i ta što se smatralo da su životinje previše različite od čoveka i inferiorne, pa se rezultati dobijeni na životinjama ne mogu primeniti na ljude. (4)
Od 18-tog veka postepeno se prihvata mišljenje da eksperimenti na životinjama doprinose napretku medicine i da daljnji razvoj medicine zavisi od daljnjeg eksperimentiranja na životinjama. 19. vek donosi pokrete protiv vivisekcije i eksperimenata na životinjama prvo u Engleskoj, a zatim u Francuskoj. U Engleskoj se osniva prvo udruženje za zaštitu životinja i donesen je prvi zakon o zaštiti životinja u pokusima „Akt o okrutnosti prema životinjama“ („Cruelty to Animals Act“). Velik doprinos debati o eksperimentiranju na životinjama dao je Jeremy Bentham u svom delu „Uvod u principe morala i legislative“ („Introduction to the Principles of Morals and Legislation“) iz 1789. godine. (4)
Od 19. veka, eksperimenti na životinjama postaju sve učestaliji. Razlozi su brojni, počevši od otkrića metoda anestezije, do razvoja ostalih biomedicinskih disciplina, farmakologije, toksikologije, virologije, imunologije itd. Naročiti porast korištenja pokusnih životinja prati razvoj farmaceutske industrije, čime se korištenje životinja u pokusima aktualizira dovodeći problematiku do nivoa političkog pitanja. Povećava se ne samo ukupni broj korištenih životinja, nego i broj korištenih vrsta. Do kraja 19. veka u pokusima su uglavnom korištene domaće životinje, dok je druga polovica 20. veka donela procvat uzgoja malih glodavaca, posebno miševa i štakora, kao i veliki porast broja korištenih životinja. Smatra se da je u svetu 1960. godine korišteno oko 30 miliona kičmenjaka, dok je 1970. taj broj narastao između 100 i 200 miliona. Broj korištenih životinja je u 80-tim počeo opadati. Prema procjeni britanskog udruženja za aboliciju vivisekcije (BUAV) i danas se godišnje vrše pokusi na oko 100 miliona kičmenjaka, od toga 10-11 miliona u Evropi. Oko 90% od tog broja otpada na laboratorijske štakore i miševe. (4)

Vrste eksperimentalnih životinja

Poslednjih godina povećan je interes za korištenje riba kao eksperimentalnih i laboratorijskih životinja. Jedan od razloga za korištenje riba je činjenica da mnoge vrste riba proizvode velik broj jaja u konstantnim razmacima. Kako su jaja prozirna vrlo lako se mogu pratiti rani razvojni stadijumi riba te spoljašnji utecaji na njih. Njihova telesna temperatura varira u odnosu na temperaturu okoline i vrlo su ograničenih mogućnosti regulisanja i zadržavanja konstantne temperature tela. U laboratorijskim istraživanjima najčešće se koriste vrste iz sledećih skupina riba: pastrmske vrste (Salmonidae) – potočna pastrmka, kalifornijska pastrmka, losos; ciklidi (Cichlidae) – Tilapia, Archocentrus nigrofasciatus; šaranske vrste (Ciprinidae) – zebrice, zlatna ribica; morske ribe – bakalar, komarča, lubin. (5)
Od vodozemaca u laboratorijskim istraživanjima uglavnom se koriste žabe. U istraživanjima se koriste razne kopnene, poluvodene i prave vodene vrste žaba. Koža vodozemaca relativno je tanka i propusna, te vlažna s velikim brojem žlezda. Osim zaštitne uloge vodozemci se kožom koriste i za razmenu gasova i regulaciju količine vlage. Vrste koje se najčešće koriste u laboratorijskim istraživanjima su iz roda Xenopus (X. laevis i X. borealis) koje su potpuno vodene i roda Rana (R. pipiens i R. temporaria) koje su uglavnom kopnene. (5)
Gmazovi su jedna od najraznolikijih i najzanimljivijih grupa kičmenjaka. Najlakše za držanje i bilo kakva laboratorijska istraživanja su mali gušteri i neke zmije. Gmazovi se koriste u genetskim istraživanjima, embriologiji, razvojnoj biologiji, etologiji (ponašanja), endokrinologiji i imunologiji. Pomoću gmazova istražuje se i agresija, fiziologija stresa, reprodukcija i toksikologija. Vrsta koja se najčešće koristi je gušter zeleni anolis (Anolis carolinensis). (5)
Inteligencija ptica, složenost ponašanja i sposobnost da podnose fizičku bol bili su dugo podcenjivani i one su bile smatrane inferiornim prema sisarima u svakom pogledu. Prednost ptica je to što su znatno lakše za razmnožavanje i održavanje zbog svoje male veličine. Međutim, s obzirom da su to vrlo aktivni i pokretljivi organizmi, njihovo držanje i osiguravanje potreba u laboratorijskim uslovima je nešto složenije. Pile (kokoš – Gallus domesticus) je klasična i tipična životinja za embriološka istraživanja. U novije vreme koristi se i za proizvodnju antitela jer je sakupljanje antitela iz jajeta potpuno neinvazivno, a i sama imunizacija je neinvazivna (kroz mukoznu membranu jednjaka). Osim kokoši u istraživanjima se ponekad koriste i pura (Meleagris gallopavo), prepelica (Coturnix spp.), golub (Columba livia), čvorak (Sturnus vulgaris), zebe i patke. (5)
Kada su u pitanju sisari, u najvećem broju istraživanja (preko 85%) koriste se glodavci zbog svoje male veličine, te lakšeg i isplativijeg držanja. U određenom broju istraživanja u laboratorijama koriste se vrste sisara iz redova zveri (Carnivora) i parnoprstaša (Artiodactyla). Među njima najčešće se koriste pas (Canis familiaris), mačka (Felis catus), svinja (Sus domesticus), ovca (Ovis aries) i koza (Capra hircus) koje se često, radi pojednostavljivanja terminologije, naziva zajedničkim imenom "velike životinje". Poput primata, "velike životinje" imaju vrlo značajnu ulogu u laboratorijskim istraživanjima zbog svoje biohemijske i fiziološke sličnosti čoveku. Saznanja koja se sakupe vrlo su vredna veterinarima u dijagnosticiranju i lečenju bolesti samih tih životinja. (5)
Pas (Canis familiaris) pripada u red zveri (Carnivora) i porodicu Canidae. Iako je primarno mesožder, smatra se omnivornim predatorom, lovcem. Pas ima izuzetno razvijeno čulo njuha i čuje 4 puta bolje od čoveka. Poznato je da vidi u boji, ali vidi samo plavu i žutu boju dok crvenu ne vidi. Pas je nastao od vuka procesom domestifikacije i selekcije od strane čoveka. Ima potrebu za životom u "čoporu" sa drugim psima ili čovekom i taj socijalni kontakt mu je izuzetno važan. Procesom selekcije i ukrštanja nastalo je više od 100 vrsta pasa pri čemu se njihove veličine kreću od 500 g (čivaua) do 100 kg (bernardinac). Godišnje se u svetu u istraživanjima i testiranjima koristi više od 140 000 pasa. Veličina pasmine za laboratorijska istraživanja je presudna u odabiru. Prevelike pasmine (nemački ovčar, labrador) su složenije i teže za uzgajanje, držanje i istraživanje. Optimalna pasmina je Beagle zbog manje veličine, dobrog karaktera, male potrebe za brigom i zato što nema posebnih anatomskih i genetskih anomalija. Beagle-i se također lako razmnožavaju i jednostavno drže u grupama. Psi se mogu nabavljati od specijaliziranih uzgajivača (bolje i češće) ili iz skloništa (azila) za pse. (5)
Mačka (Felis catus) također pripada u grupu zveri, porodicu Felidae. Mačka je primer pravog mesoždernog predatora (lovca). U prirodi je izrazito solitarna i teritorijalna životinja. Uz čoveka se domestificirala, pa danas postoji velik broj različitih vrsta. Mačka se koristi u velikom broju različitih istraživanja i ispitivanja npr. starenja, sluha, probave, ponašanja, raka, endokrinološkim istraživanjima, krvotoka, genetskim, imunološkim, istraživanjima zaraza, nervnog sistema, mišićno-skeletnim, istraživanjima oka, kože, disanja, toksikologije i dr. Problem sa mačkama je što loše podnose uzimanje krvi, stres i mogu ozlediti istraživače. Stoga se vrlo često koriste sredstva za smirenje ili imobilizacijska pomagala. (5)
Svinja (Sus domesticus) taksonomski pripada redu parnoprstraša (Artiodactyla), pripada u strvinare (sakupljače). Svinje su vrlo inteligentne i aktivne životinje koje su uglavnom prilično mirne i pitome. Ženke s mladima i odrasli mužjaci mogu biti agresivni i treba ih tretirati s oprezom. Usled procesa pripitomljavanja, selekcije i ukrštanja nastale su različite vrste, kojima se veličine kreću od 15 do 300 kilograma. Veličina tela i kostura, koža, zubi, probavni sistem, položaj srca i krvotok svinje, vrlo su slični onima kod čoveka. Životinje imaju dug životni vek pa su odlični test organizmi za istraživanja bolesti srca i kardiovaskularnog sistema, gerontologije i toksikologije. Držanje svinja je nešto složenije od ostalih "velikih životinja" zbog prosečne veličine, ali i životnih potreba. Zato su uzgojene pojedine vrste koje su prosečno manje (Göttingen Minipig) i čija masa se kreće do 40 kg. Svinje je preporučljivo držati u grupama jer preferiraju kontakt s drugim pripadnicima vrste pri čemu razvijaju strukturu (hijerarhiju) dominacije. (5)
Ovca (Ovis aries) pripada u isti red (parnoprstaši) kao i svinja, ali je i pripadnik grupe preživača (Ruminantia). S obzirom na tip ishrane (8-10 sati dnevno pasu) ovca ima potrebu za stalnim kretanjem (nekoliko kilometara dnevno) u potrazi za hranom pa je potreban velik prostor za njihovo uzgajanje. Prirodno su plašljive i snažno vezane za život u stadu. Ovce se koriste u kardiovaskularnim istraživanjima, istraživanjima reprodukcije, genetskim istraživanjima i proizvodnji antitela. (5)
Primati su od svih životinja najbolji za eksperimentalna istraživanja zbog visoke sličnosti sa čovekom u svakom pogledu. Primati ili majmuni (Primates) su red sisara (Mammalia). Udovi su im petoprsti, a stopala plantigradna (peta je na tlu). Poseduju stereoskopski, binokularni vid i vidni aparat im je znatno poboljšan dok se mirisni smanjio u poređenju s drugim sisarima. Lubanja je velika, a mozak i kora velikog mozga su dobro razvijeni. Pokazuju složeno socijalno ponašanje i komunikaciju. U odnosu na ostale sisare u proseku imaju duži životni vek i manji broj potomaka (1-2). Velik broj vrsta primata smatra se ugroženim prvenstveno zbog antropogenih uticaja. Uglavnom naseljavaju tropska i subtropska šumska područja. Primati se najčešće hrane biljkama, voćem, kukcima ili su oportunisti (svejedi). Zbog anatomskih, fizioloških, reproduktivnih i etoloških sličnosti s čovekom, kao i zbog sličnih bolesti, koriste se u velikom broju različitih istraživanja poput: toksikoloških istraživanja, studijama istraživanja SIDA-e i hepatitisa, neurološkim istraživanjima, istraživanjima ponašanja, reprodukcije i genetike. Pošto duže žive od ostalih laboratorijskih životinja mogu se koristiti kroz duži vremenski period. Potrebno je dobro poznavati svaku od vrsta kako bi se uslovi držanja životinja prilagodili potrebama svake od vrsta. (5)

Laboratorijske životinje u farmakološkim i toksikološkim istraživanjima

Dosadašnje spoznaje u farmakologiji i toksikologiji većim su delom postignute kroz eksperimente na laboratorijskim životinjama. Danas postoji veliki broj sofisticiranih protokola u farmakologiji i toksikologiji koji uključuju eksperimente na laboratorijskim životinjama, posebno u pretkliničkim istraživanjima novih lekova. Na stranicama www.ich.org (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH)) nalaze se direktive koje govore koje standarde sigurnosti moraju zadovoljiti lekovi za ljudsku upotrebu. Životinjski farmakološki modeli mogu se podeliti u dve grupe: životinjski modeli u farmakodinamici i životinjski modeli u farmakokinetici. Regulatorne agencije izdaju direktive sa detaljnim protokolima koje varijable treba meriti kako bi se utvrdio pojedini tip toksičnosti, poput primjerice europske OECD (www.oecd.org), zatim European medical agency (http://www.ema.europa.eu/ema/index) ili američke FDA (www.fda.gov/ebr/guidelines/). (6)
Laboratorijski glodavci (miš i štakor) najčešći su modeli za procenu toksičnosti. Nezamenjivi su u određivanju otrovnosti (LD50) pojedine supstance za organizam sisara ali i za studije specifičnih učinaka (hepatotoksičnost, neurotoksičnost, imunotoksičnost, nefrotoksičnost, toksikokinetičke i biotransformacijske studije). Kunići su također čest toksikološki model posebno u istraživanjima dermalne toksičnosti i iritacije očiju. Od životinja koje nisu glodavci u toksikološim su se istraživanjima uglavnom koristi pas (najčešće pasmina je Beagle) a u novije vreme patuljaste svinje koje sve više zamenjuju pokuse na psima. Mačke i primati se koriste relativno retko, iako primati imaju najsličniju biotranformacijsku fiziologiju u poređenju sa ljudskim organizmom. Štakori i psi su najčešći modeli ekskrecije toksina putem žuči i opstrukciju žuči toksinima. Postoje i neka fiziološka ograničenja koja uslovljavaju odabir vrste životinje za toksikološka istraživanja, npr. u istraživanjima biotransformacije i ekskrecije glukuronski put je manje zastupljen kod mačke, acetilacija kod psa, sulfokonjugacija kod svinje i sl. (6)

Osnovni testovi toksičnosti

Testovi toksičnosti na životinjama zasnovani su na dve pretpostavke:

• Efekti koji nastaju na životinjama su isti kao i efekti na ljudima tj. ista doza po jedinici površine daje isti efekat;
• Izlaganje životinja visokim dozama toksičnih supstanci je neophodan i pouzdan metod za otkrivanje efekata kod ljudi jer je stepen nastajanja nekog efekta u populaciji veći ako se povećava doza ili ako je broj izloženih pojedinaca veći.

Treba imati u vidu da se testovi toksičnosti rade na mladim i zdravim životinjama pod kontrolisanim uslovima, a da lekove uglavnom retko koriste mladi i zdravi ljudi, već stariji ljudi promenjenih fizioloških funkcija, često sa štetnim navikama (konzumiranje alkohola, pušenje) što značajno utiče na biotransformaciju, eliminaciju i efikasnost leka. (3)
Određivanje doze neke supstance i njenog toksičnog učinka u živom organizmu u određenom vremenu izloženosti temelj je toksikoloških i farmakoloških istraživanja. Istraživane supstance se najčešće primenjuju na jedan od tri načina: dermalno, inhalacijski i oralno. Testove koji se provode možemo prema tome podijeliti na:
1. Testove određivanja efektivne doze ED50 (za lekove) i letalne doze LD50 (za veliki broj supstanci kojima je čovek svakodnevno izložen). Ovakvi testovi služe kao podloga za procenu doze koja je otrovna za čoveka i za opis otrovnosti supstanci;
2. S obzirom na vreme izloženosti/ponavljanje doze i toksični ili farmakološki učinak: subakutne, subhronične, hronične i celoživotne testove toksičnosti (za lekove je testiranje vremena izloženosti uglavnom samo u prve tri kategorije a ređe celoživotno). (6)

Ispitivanje toksičnosti posle primene jedne doze supstance (akutna toksičnost)

Cilj ovog ispitivanja je naći odgovor što bi se dogodilo ako bi čoveka izložili velikoj dozi ispitivane supstance. Reč je o prvom testu toksičnosti supstance koji se radi na životinjama, najčešće pacovima i miševima, koji treba dati podatke o:

• LD50 (letalnoj dozi u mg/kg telesne težine koja uzrokuje smrt kod 50% tretiranih životinja) koja pruža mogućnost poređenja sa drugim supstancama
• ciljnim organima i drugim znakovima akutne toksičnosti
• eventualnoj reverzibilnosti uočenih efekata
• dobijene doze su osnova za druge testove toksičnosti. (3)

Za izvođenje klasičnog LD50 testa za jednu supstancu je potrebno i do 140 životinja (4-6 doznih grupa, po 10 životinja muškog i 10 ženskog pola, uz kontrolnu grupu), što je veliki problem zbog tendencije smanjenja broja životinja uključenih u eksperiment. Danas se rade LD50 testovi sa tri dozne grupe po 5 životinja samo jednog pola, ili tzv. metoda toksičnih klasa, koje uključuju znatno manji broj životinja. (3)

Ispitivanje toksičnosti posle ponovljene primene leka

Testovi  lokalne podnošljivosti

Cilj testa lokalne podnošljivosti je da se otkrije kako se ispitivana supstanca podnosi na mestu primene. Pri tom treba razmotriti sve raspoložive podatke o fizičkohemijskim osobinama supstance u formulaciji (pH, rastvarači), kao i sve farmakološke, toksikološke i farmakokinetičke podatke o ispitivanoj supstanci. Ispitivanja se rade na samo jednoj životinjskoj vrsti, način primene mora biti istovetan sa planiranim načinom primene kod čoveka, a ispitivanje traje do četiri nedelje. Pri izvođenju eksperimenta potrebno je smanjiti bol i patnju životinja na način koji neće uticati na rezultat ispitivanja, a ukoliko se pojave ozbiljni neželjeni efekti eksperiment se mora prekinuti. U eksperimentu učestvuju i životinje koje se tretiraju samo ekscipijensom.(3)

Test iritacije oka

Test iritacije oka (Draize-ov test) radi se aplikacijom ispitivane supstance u obliku kapi u jedno oko kod 6 kunića. Cilj testa je ispitivanje supstanci koje će se kod čoveka koristiti u obliku kapi i aplicirati u oko. Rekcija se posmatra 72 sata pri čemu drugo oko kunića služi kao kontrola. Reakcije se mogu primetiti na mrežnjači, rožnjači i zenici, a efekti mogu biti reverzibilni i ireverzibilni. Ovaj test se zbog bola koji može da izazove kod kunića ne preporučuje. (3)

Testovi  dermalne toksičnosti

Testovi dermalne toksičnosti koriste se za ispitivanje iritacija, inflamacija i edema koji ispitivana supstanca može izazvati na koži nakon lokalne aplikacije. Postoje dva testa:

• Test primarne dermalne iritacije – test je za određivanje direktnih toksičnih efekata na kožu. Izvodi se na kunićima.
• Test senzitizacije kože – gotova formulacija ispitivane supstance perkutano ili intradermalno nanosi se na kožu zamorca tokom par nedelja. Kada prođe dve do tri nedelje od zadnje aplikacije, daje se mala doza ispitivane supstance i posmatra se da li će doći do alergijske reakcije na mestu aplikacije (inflamacija, edem, crvenilo). (3)

Osnovni testovi genotoksičnosti

Ovim testovima otkrivaju se mutacije u DNK i promene u strukturi i broju hromozoma značajne za prenos naslednih osobina i za proces kancerogeneze. Testovi za ispitivanje genotoksičnosti dele se na tri grupe:

Testovi mutacija na genima – obuhvataju šest testova:

• Test reverznih mutacija na Salmonella typhimurium
• Test reverznih mutacija na Echerichia coli
• Test genskih mutacija u kulturi ćelija sisara
• Test polno vezanih recesivnih mutacija na vinskoj mušici (Drosophila melanogaster)
• Test genskih mutacija na kvascima (Saccharomyces cervisiae)
• Spot test kod miša

Testovi su brzi, jednostavni, ekonomični, reproduktivni, i daju precizne podatke o reakcijama ispitivanih supstanci sa DNK i indukciji mutacija na genima, ali rezultati dobijeni na bakterijama i gljivicama nisu pouzdan pokazatelj tog agensa da indukuje slične efekte i u ćelijama sisara. Pouzdani pokazatelji o mutacijama na genima viših organizama dobijaju se iz testova sa vinskom mušicom, kvascima i kulturom ćelija sisara. (3)

Testovi promena na hromozomima – obuhvataju šest testova:

• In vitro citogenetski test
• In vivo citogenetski test
• Mikronukleus test
• Test dominantno letalnih mutacija
• Test naslednih translokacija
• Citogenetski test na germinativnim ćelijama sisara

In vivo citogenetski test ispituje se na ćelijama koštane srži glodara i ima prednost jer se životinje tretiraju ispitivanom supstancom, posle nekog vremena se uzimaju ćelije za citogenetsku analizu pri čemu se vrši normalan metabolizam, distribucija i eliminacija ispitivane supstance, reparacija DNK i ćelijska proliferacija. (3)

• Testovi efekata na nivou DNK – obuhvataju tri testa:
• Test oštećenja i reparacije DNK
• Test mitotske rekombinacije na Saccharomyces cervisiae
• Izmena sestrinskih hromatida in vitro. (3)

Testovi  kancerogenosti

Cilj testova kancerogenosti je utvrđivanje kancerogenog potencijala ispitivane supstance na eksperimentalnim životinjama i procena eventualnog kancerogenog rizika za ljude. Treba imati na umu da sve supstance koje su kancerogene za životinje ne moraju biti istovremeno kancerogene i za ljude, ali postoji velika verovatnoća da jesu. Ispitivanje kancerogenosti je dugotrajno i skupo, a neophodno je kod supstanci koje bi se koristile u terapiji 6 meseci i duže te ako su u prethodnim toksikološkim studijama otkrivene neoplastične lezije. Radi se na dve vrste životinja npr. mišu i pacovu, kod kojih je metabolizam ispitivane supstance poznat i sličan metabolizmu ljudi. Izbegavaju se vrste kod kojih je česta pojava spontanih tumora. Postoje tri dozne grupe, u svakoj doznoj grupi nalazi se po 50 životinja oba pola i provode se dve kontrolne grupe sa po 50 životinja svakog pola. Test traje od 18 do 24 meseca zavisno da li je reč o mišu ili pacovu. Studija se može i produžiti ukoliko preživi dovoljan broj životinja. Na kraju studije sve se životinje žrtvuju, izvodi se kompletna kliničkohemijska analiza krvi i urina, radi se obdukcija, makroskopski i histopatološki pregled organa. (3)

Testovi  reproduktivne i razvojne toksičnosti

Cilj ovih testova je karakterizacija toksičnog profila ispitivane supstance prateći ciklus reprodukcije, ferliteta, embrionalnog i fetalnog razvoja, kao i prenatalni i postnatalni razvoj uključujući i materinsku funkciju. (3)

Testovi feriliteta i ranog embrionalnog razvoja do implantacije

Ovi testovi daju uvid u toksične efekte posle tretiranja mužijaka i ženki pre parenja, u fazi parenja i implatancije. Koristi se po 20 pacova oba pola po doznoj grupi, pri čemu se ženke tretiraju 14 dana, a mužjaci 70 dana pre parenja. U toku četrnaestog dana graviditeta iz svake dozne grupe se žrtvuje po 10 ženki i određuje smrtnost embriona. Mužijaci se žrtvuju nakon parenja. Žrtvovanim životinjama radi se kompletna kliničkohemijska analiza krvi i urina, vrši se obdukcija, makroskopski i histopatološki pregled polnih organa. Nakon rođenja mladunaca prati se preživljavanje i status mladunaca 4.,7.,14. i 21. dana starosti, nakon čega se jedna grupa žrtvuje, dok se druga ostavlja u životu i prati se njihov dalji razvoj. (3)

Testovi efekata na prenatalni i postnatalni razvoj

Testovi efekata na pre i postnatalni razvoj daju uvid u neželjena dejstva kod gravidnih ženki koje hrane mladunce i efekat na razvoj mladunaca od implatacije do trenutka kad oni počnu samostalno da se hrane čvrstom hranom. Mladunci se prate do polnog sazrevanja. Do kraja laktacije pacovi se tretiraju ispitivanom supstancom, nakon čega se prati odrastanje mladunaca do momenta parenja. Žrtvovanim životinjama radi se kompletna kliničkohemijska analiza krvi i urina, vrši se obdukcija, makroskopski i histopatološki pregled organa, određuje se broj nenormalnih implantata, broj živih i mrtvih mladunaca posle rođenja, prati se njihov rast i razvoj. (3)

Testovi embriotoksičnosti

Testovi embriotoksičnosti imaju za cilj otkrivanja neželjenih dejstava ispitivane supstance kod gravidnih ženki i razvoj embriona i fetusa nakon izlaganja gravidne ženke ispitivanoj supstanci. Obično se rade na pacovu ili kuniću. Ženke se žrtvuju dan nakon porođaja i ispituje se svaki fetus ponaosob. Radi se obdukcija i makroskopski pregled ženki, organi se podvrgavaju histološkim analizama, odeređuje se broj žutih tela, broj živih i mrtvih implatata, pregledava placenta itd. (3)

Zaključak

• Istraživanja na eksperimentalnim životinjama su nužna za unapređenje medicinske brige za sve ljude. (1)
• Deklaracija o biomedicinskim istraživanjima zahteva da se istraživanja na ljudima temelje na rezultatima ogleda na životinjama, ali zahteva i da se poštuje dobrobit životinja na kojima se istraživanja obavljaju. (1)
• Mora se osigurati humani postupak sa oglednim životinjama i odgovarajuća veterinarska nega. Eksperimentalnim životinjama moraju se osigurati najbolji mogući uslovi života. Eksperimenti moraju udovoljavati svim pravilima za humano rukovanje, udomljavanje, negu, postupak i prevoz životinja. Osoblje laboratorije mora se prema životinjama etično ophoditi, kao sa bićima koja osećaju, naročito moraju izbegavati ili na najmanju moguću meru svesti da životinje osećaju nelagodu, patnju i bol. Ogledi sa životinjama moraju se izvoditi uz sedaciju, analgeziju ili anesteziju. Bolni postupci ne smeju se sprovoditi na neanesteziranim životinjama koje su samo paralisane hemijskim sredstvima. Na kraju ili tokom eksperimenta, životinje koje bi podnosile hronični bol, patnju, nelagodu ili onesposobljenost moraju se bezbolno žrtvovati. (1)
•  Kada god je moguće, umesto eksperimenta na životinjama treba primeniti matematičke modele, kompjuterske simulacije i biološke in vitro oglede. Ogledi na životinjama mogu se preduzeti tek nakon procene njihovog značaja za zdravlje ljudi i životinja, te za napredak bioloških nauka. Treba upotrebiti najmanji mogući broj eksperimentalnih životinja za dobijanje naučno vrednih rezultata. (1)
• Uvek se voditi tzv. pravilom tri R (eng. replacement, reduction, refinement), tj. zamena, smanjenje i usavršavanje. Prvi aspekt podrazumeva zamenu životinje eksperimentalnom životinjom niže filogenetske vrste ili korištenje matematičkog modela, kompjuterske simulacije i biološkog in vitro ogleda. Drugi aspekt podrazumeva smanjenje broja životinja u eksperimentu. Treći aspekt podrazumeva usavršavanje eksperimentalne procedure i kadra da bi se umanjila etička cena. (1)
• U edukativne svrhe potrebno je koristiti alternativne metode koje studentima u potpunosti objašnjavaju datu materiju, a isključuju korištenje i naročito usmrćivanje životinja, npr. video zapisi, kompjuterske simulacije, modeli i slično. (1)

• Marić, J.: Medicinska etika – XIV dopunjeno i prerađeno izdanje - Megagraf, Beograd, 2005, 390-1.
• Parojčić, D.: Razvoj etike u farmaciji - Konstisi, Beograd, 2006, 153.
• Jokanović, M.: Toksikologija – Princip press - Portal, Beograd, 2010, 368-83.
• Erhardt, J.: Program osposobljavanja osoba koje rade s pokusnim životinjama, Uvod u znanost o labaratorijskim životinjama – PMF, Zagreb, 2012, 10-1.
• Ćaleta, M.: Program osposobljavanja osoba koje rade s pokusnim životinjama, Komparativna biologija „od riba do primata“– PMF, Zagreb, 2012, 36-50.
• Đikić, D.: Program osposobljavanja osoba koje rade s pokusnim životinjama, Labaratorijske životinje u farmakološkim i toksikološkim istraživanjima – PMF, Zagreb, 2012, 140-4.

Student: Dragana Martinović

 preuzmi seminarski rad u wordu » » »

Besplatni Seminarski Radovi